鞣花酸(Ellagic acid，EA)是一種具有生物活性的酚類化合物，廣泛存在于水果、堅(jiān)果等植物組織中，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，是一種沒食子酸的二聚衍生物。在自然界中，鞣花酸主要以縮合形式(如鞣花單寧等)存在。鞣花酸基本無毒性，對(duì)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的癌變及其它多種癌變具有明顯的抑制作用，如結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、淋巴癌等。此外，鞣花酸還具有抗氧化、抗炎癥、抑菌、抑制黑色素生成、改善白血病等功效。由于其優(yōu)異的生物活性，鞣花酸被廣泛應(yīng)用于保健食品、醫(yī)療、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。
有研究表明，茶葉是鞣花單寧和鞣花酸的重要膳食來源，鞣花單寧通過人體腸道微生物轉(zhuǎn)化，會(huì)轉(zhuǎn)化為鞣花酸等代謝產(chǎn)物。
▲ 人體代謝路徑
普洱熟茶作為云南名茶，是由云南大葉種曬青毛茶制成的一種獨(dú)特微生物發(fā)酵茶。普洱熟茶“固態(tài)發(fā)酵”的實(shí)質(zhì)主要是濕熱作用、酶作用以及微生物作用。大葉種曬青毛茶發(fā)酵過程中，微生物代謝釋放大量熱量，其分泌的酶與茶葉內(nèi)含物發(fā)生激烈的酶促反應(yīng)，二者均能促進(jìn)具有熱不穩(wěn)定性的鞣花單寧(如木麻黃素)分解形成鞣花酸。
建立普洱熟茶中鞣花酸含量的檢測(cè)方法，可滿足普洱熟茶中特征活性成分的質(zhì)量控制需求，同時(shí)有助于普洱茶發(fā)酵過程中特征性物質(zhì)的變化趨勢(shì)及微生物的代謝規(guī)律研究，為普洱茶的工業(yè)化可控發(fā)酵提供方法依據(jù)。
01
材料與方法
1、儀器與設(shè)備
Waters e2695 高效液相色譜儀(美國(guó)，Waters公司);Waters 2995 PDA(光電二極管列陣檢測(cè)器，美國(guó)，Waters公司);WD-9415B超聲儀(北京六一儀器廠);H1850R低溫離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司);VORTEX 3旋渦混勻器(德國(guó)，IKA公司);分析天平(精度0.0001 g，美國(guó)，OHAUS公司);Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)，Agilent公司)。
2、材料與試劑
針式過濾器(0.45 μm，尼龍66，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);乙腈、甲醇均為色譜純(德國(guó)MERCK公司);水為超純水;磷酸為分析純;鞣花酸對(duì)照品(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)。
3、色譜條件
Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);0~20 min，0.2%磷酸∶乙腈(85∶15，體積比)，等度洗脫;流速：1 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL，柱溫35 ℃;光電二極管陣列檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。
4、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
稱取一定量的鞣花酸對(duì)照品，用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為60 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-4 ℃避光保存。使用前，準(zhǔn)確移取適量鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇配置成質(zhì)量濃度分別為1~30 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，于-4 ℃避光保存。
5、樣品處理
稱取適量(精確至0.0001 g)均勻研磨的熟茶樣品于50 mL離心管中，加入適量提取溶劑(水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、純甲醇)，使料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50，超聲一定時(shí)間(30 min、45 min、60 min)，5000 r/min下離心10 min，取上清液于100 mL容量瓶中，重復(fù)數(shù)次(重復(fù)0次、1次、2次和3次，即提取1次、2次、3次和4次)，合并上清液，用純水定容至100 mL，搖勻，過0.45 μm水相濾膜后，待測(cè)。
02
結(jié)果與分析
1、高效液相色譜條件優(yōu)化
使用水-甲醇、水-乙腈、磷酸水溶液-甲醇和磷酸水溶液-乙腈(磷酸濃度為0.2%、0.3%、1%)為流動(dòng)相，等度洗脫，考察不同流動(dòng)相種類、比例及pH對(duì)普洱熟茶中鞣花酸分離效果的影響。從目標(biāo)峰的峰形、與干擾峰的分離度等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。
結(jié)果表明，流動(dòng)相為水-有機(jī)相體系時(shí)，鞣花酸的色譜峰展寬、拖尾嚴(yán)重，識(shí)別困難。在洗脫體系中加入不同濃度的磷酸進(jìn)行峰形優(yōu)化，鞣花酸色譜峰的峰寬變窄，峰形對(duì)稱略有拖尾。但不同濃度的磷酸，對(duì)峰形變化影響不明顯，因此洗脫體系選用0.2%磷酸的濃度。分別使用甲醇和乙腈有機(jī)相洗脫鞣花酸對(duì)照品，發(fā)現(xiàn)乙腈洗脫體系鞣花酸的保留時(shí)間更短，且水溶液-乙腈體積比為85∶15時(shí)樣品中鞣花酸目標(biāo)峰前后雜質(zhì)峰較少，利于定性和定量，能顯著提高檢測(cè)效率。
因此，確定普洱熟茶中鞣花酸定量檢測(cè)的流動(dòng)相為0.2%磷酸水溶液-乙腈(體積比為85∶15)，保留時(shí)間為16.0 min(±0.5 min)，如圖2所示。
2、樣品前處理優(yōu)化
分別研究不同料液比、不同提取液種類、不同提取時(shí)間和不同提取次數(shù)對(duì)鞣花酸提取率的影響。在相同檢測(cè)條件下對(duì)比鞣花酸色譜峰和雜質(zhì)色譜峰(咖啡因等)的峰高或含量，從而確定最優(yōu)的前處理方法。
如圖3所示，1∶30、1∶40、1∶50提取組鞣花酸含量顯著低于1∶20提取組，鞣花酸含量隨料液比降低而顯著降低，而1∶10、1∶20提取組間鞣花酸含量無顯著差異，當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，咖啡因峰高超過2.0 AU，沒食子酸峰高達(dá)1.8 AU，考慮到過大響應(yīng)值可能對(duì)檢測(cè)器造成損耗，因此，1∶20為最適料液比。
選擇水、甲醇以及不同比例甲醇水為提取溶劑，評(píng)價(jià)普洱熟茶中鞣花酸的提取率。如圖4所示，與水提取組相比，純甲醇、75%甲醇組鞣花酸提取率顯著低于水提取組，50%甲醇、25%甲醇組鞣花酸提取率低于水組，但無顯著差異，綜合考慮實(shí)驗(yàn)成本及環(huán)境污染等因素，選擇水為最適提取液。
考慮不同提取時(shí)間對(duì)普洱熟茶中鞣花酸提取率的影響。如圖5所示，鞣花酸含量隨著提取時(shí)間的增加而增加，但提取30 min與提取45 min相比無顯著差異，為提高檢測(cè)效率，確定提取時(shí)間為30 min。
考慮不同提取次數(shù)對(duì)普洱熟茶中鞣花酸提取率的影響，根據(jù)已確定的料液比(1∶20)、提取液(水)和提取時(shí)間(30 min)，分別超聲提取1次、2次、3次和4次。如圖6所示，鞣花酸含量隨著提取次數(shù)的增加而增加，提取3次與提取1次和2次相比有顯著差異，且與提取4次相比有差異但不顯著，考慮到檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)和檢測(cè)效率，最終采用3次提取。
3、方法線性范圍與相關(guān)系數(shù)
采用上述所確定的方法檢測(cè)鞣花酸對(duì)照品，外標(biāo)法定量，以其峰面積為縱坐標(biāo)(y軸)，其濃度為橫坐標(biāo)(x軸)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程、相關(guān)系數(shù)見表1。在0.6~60 mg/L范圍內(nèi)鞣花酸的線性良好。鞣花酸的檢出限(LOD)為13.5 mg/kg，定量限(LOQ)為檢出限的3.33倍，即45.0 mg/kg。
4、儀器精密度、方法重現(xiàn)性
取上述同一鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10 μL，以鞣花酸峰面積，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.28%(n=6)。
根據(jù)“1.5”所述，按照最終確定的前處理方法進(jìn)行同一樣品平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)平行樣品進(jìn)樣1次，進(jìn)樣量10 μL，以各樣品的鞣花酸含量，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.7%(n=6)，表明該方法重復(fù)性較好。
5、普洱熟茶中鞣花酸的含量
對(duì)18個(gè)市售普洱熟茶中鞣花酸的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。樣品中鞣花酸含量范圍為176.6~398.1 mg/kg。
03
討論
不同普洱熟茶中鞣花素含量差異明顯。普洱熟茶中的鞣花酸可能由茶葉中的鞣花單寧類物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來，不同等級(jí)、不同地區(qū)的原料鞣花單寧類物質(zhì)含量不同，且發(fā)酵程度不同也會(huì)影響普洱熟茶中鞣花酸的含量，具體的影響因素及影響程度有待進(jìn)一步研究。
目前，利用高效液相色譜法測(cè)定鞣花酸含量的文獻(xiàn)中，檢測(cè)對(duì)象多為水果和藥用植物，涉及普洱茶中鞣花酸含量的檢測(cè)方法鮮有報(bào)道。部分文獻(xiàn)中所述方法提取過程漫長(zhǎng)、提取溶液種類復(fù)雜且環(huán)境危害較大?；蛞騼x器條件配適度較差，目標(biāo)物與雜質(zhì)峰未有效分離，導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確。
文章所述方法不僅可用于普洱熟茶中鞣花酸的含量測(cè)定，也適用于普洱熟茶深加工產(chǎn)品，且為普洱熟茶發(fā)酵過程中鞣花酸變化趨勢(shì)的研究提供方法基礎(chǔ)。現(xiàn)行大部分檢測(cè)方法使用的提取溶劑為有機(jī)試劑，前處理包括長(zhǎng)時(shí)間浸泡或水浴回流及濃縮、蒸干等步驟，相較于這些方法，本方法僅使用純水超聲提取，方法便捷、成本低廉、環(huán)境危害小、可批量前處理。且方法檢測(cè)周期較短，樣品前處理2 h，比其他需要有機(jī)試劑預(yù)先浸泡數(shù)小時(shí)再提取的方法更高效。本方法目標(biāo)峰前后雜質(zhì)峰少且較小，分離度較文獻(xiàn)方法高，可有效定量目標(biāo)峰。
許芮菁
助理工程師，就職于云南大益微生物技術(shù)有限公司、云南省普洱茶發(fā)酵工程研究中心，主要從事茶葉及其微生物代謝成分檢測(cè)研究。參與云南省科技廳重大科技專項(xiàng)子項(xiàng)目。發(fā)明專利公開3件，受理3件;在核心期刊發(fā)表論文1篇。
具體內(nèi)容詳見《中國(guó)茶葉加工》雜志，2022年第2期文章《高效液相色譜法測(cè)定普洱熟茶中鞣花酸含量》，頁碼：63-68，作者：許芮菁，劉敏，楊銳，高林瑞，丁章貴*，陳丹丹*。
來源：中國(guó)茶葉加工
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